细胞冻存的那些事儿

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使细胞生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术，它一般包括复苏、传代及冻存，这里增添了驯化的步骤，主要是为了得到我们需要的目标细胞，如将贴壁细胞驯化为可悬浮培养的悬浮细胞等。

通常情况下细胞实验周期较长，所以总免不了要冻存一部分细胞以备后用，那我就来说下冻存时的操作步骤和注意细节:

细胞冻存

细胞培养过程会出现污染或者有些细胞经长期传代培养后可能被诱导分化，而这时之前冻存的细胞就是重新来过的“火种”，避免全军覆没的危险；同时细胞冻存还能节省实验室空间、经费及时间成本；最重要的是确保实验的一致性和连贯性。

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞外形成冰晶会因为脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱；如细胞内冰晶形成较多会造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。在细胞冻存的过程中用来保护细胞而添加的保护剂一般分为渗透型如甘油、二甲基亚砜（DMSO）或甲醇等，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内冰晶的形成，从而减少对细胞的损伤。另一种是非渗透型的保护剂剂，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖等，可保护细胞免受伤害，提高细胞活率。

• 超低温冰箱或液氮罐

• 0.25%胰蛋白酶

• 20%以上血清的完全培养液或血清

• DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121℃蒸气高压消毒)

• 专用细胞冻存管，程序降温盒

• 吸管、离心管、喷灯、冻存管架

 冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

无血清细胞冻存液如Corning KM Banker II，属于即用型细胞液可直接冻存于-80℃冰箱而无需程序性降温。无血清细胞冻存液不含血清，只含DMSO、葡萄糖等营养成份，大大降低了动物血清来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险，且冻存液成分和配比明确，批次间差异很小，能够保证生长细胞状态的稳定性，细胞存活率高。

• 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液;

• DMSO有毒且皮肤会吸收，做好防护措施。DMSO本身不长菌，不需要做灭菌处理。

• 由-80℃转至液氮时迅速，避免温度上升影响细胞活性。

• 每个冻存管不要加入体积太多，以免冻存时凝固体积膨胀，撑开冻存管，且在下次复苏时，融化较慢，导致复苏后细胞存活率不高。