为什么无缝克隆成为复杂载体构建的shouxuan？
做过传统克隆的研究者大概率都遇到过这些棘手痛点：为了找到两个不重叠的酶切位点翻遍载体图谱，结果发现目的基因内部恰好有相同的酶切位点；或者载体自连背景过高，筛了几十克隆都没找到阳性结果。无缝克隆的出现彻底打破了酶切位点的限制，实现了 “无限制” 的高效组装：多片段一步拼接、无缝无疤痕、兼容大片段与复杂载体。如今，它已成为合成生物学、基因治疗等领域复杂载体构建的shouxuan技术。
一、连接非依赖克隆（LIC）
连接非依赖克隆（ligation-independent cloning，LIC）：无连接酶的低成本无缝克隆技术。
核心原理
LIC跟传统克隆技术不同，传统的限制性酶克隆使用短的粘性末端，LIC则利用T4 DNA聚合酶在特定dNTP缺失体系中仅发挥3’→5’外切酶活性，对目的片段与LIC专用载体温和消化，产生12-15bp单链同源突出端，两者通过碱基互补配对形成环状重组中间体，转入大肠杆菌后依赖宿主细胞DNA修复系统填补缺口完成共价连接；其通过反应体系中单一dNTP限制外切酶切割长度，但悬垂末端不能含该dNTP，需使用专门设计的质粒，流程简化且不依赖目的基因序列。需要注意的是，外切酶反应需严格控制条件：消化时间应设定在37℃下10-15分钟，过长会导致片段过度降解，过短则同源臂长度不足，建议通过设置时间梯度预实验优化；试剂搭配上需选择无dATP的反应缓冲液，避免激活聚合酶活性导致同源臂被填充，影响重组效率。
适用场景
a. 原核表达载体构建，如 pET 系列载体与目的基因的无缝组装，避免酶切位点对蛋白表达的影响。
b. 中片段（5-10kb）克隆，成本仅为 Gibson 组装的 1/3，适合预算有限的常规实验室。
c. 对连接酶抑制剂敏感的场景，如 PCR 产物直接克隆（无需纯化去除抑制剂）。
二、序列和连接非依赖性克隆（SLIC）
序列和连接非依赖性克隆（Sequence and Ligation-Independent Cloning，SLIC）：不仅不使用位点特异性重组，也不需要连接步骤
核心原理
SLIC 与 LIC 原理类似，均依赖 T4 DNA 聚合酶产生的单链同源突出端配对，但对同源臂长度要求更宽松（12-20bp），且可通过调整酶量适配不同片段长度。与 LIC 不同的是，SLIC 无需在引物设计中考虑特定 dNTP 的规避，完全实现无痕无序列依赖，可对 5-10 个 DNA 片段进行高效组装。其技术流程为：利用 T4 DNA 聚合酶（3'→5' 外切酶活性）处理含同源末端的目标片段和线性化载体产生黏性末端，再添加 dCTP 终止酶切反应。
SLIC 的局限性在于酶切终点难以精确控制，克隆片段与线性化载体可能被过度酶切，产生过长黏性末端并形成二级结构，导致克隆效率降低；且悬垂末端需保持可接近性，若易形成稳定单链 DNA 二级结构，则不适合使用 SLIC。
适用场景
• 多片段（4-6 个）模块化组装，如启动子 - 基因 - 终止子的标准化元件组合；
• 大片段（5-15kb）克隆，无需复杂试剂搭配，操作容错率高；
• 高通量载体构建与快速迭代实验，PCR 产物无需纯化、酶切即可直接加入反应体系。
总结：连接非依赖克隆（LIC）与序列和连接非依赖性克隆（SLIC）均为无需连接酶的体外无缝克隆技术，核心依赖片段末端同源序列互补配对，但LIC以单一T4 DNA聚合酶介导长单链突出端形成，成本极低，适配2-3个短片段常规构建，操作需精准控制外切时间；SLIC则通过多酶协同作用产生短单链同源区并修复缺口，操作更简便、阳性率更高，支持4-6个大片段（≤15kb）组装，更适配多片段模块化构建与高通量实验。
三、Gibson 组装
Gibson 组装：大片段与多片段组装的 “黄金标准”。
核心原理
Gibson 组装依赖三酶协同作用，实现一步无缝组装：
① T5 外切酶：5’→3’方向降解 DNA 末端，产生 3’单链同源臂（15-40bp），为片段配对做准备；
② Phusion 高保真聚合酶：填补同源配对后形成的缺口，修复 DNA 链完整性；
③ Taq DNA 连接酶：催化磷酸二酯键形成，完成片段间的共价连接。整个反应可在 50℃下持续 15-60 分钟，无需分步操作，支持 1-10 个片段同步组装，兼容粘性末端、平末端及高 GC 片段。
Gibson组装法概述（图片来源：NEB官网）
同源臂设计建议：长度 20-30bp，GC 含量控制在 40%-60%，避免连续重复序列，可通过 NEB 的 Gibson Assembly Designer 工具自动设计引物。
NEB推出的NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液|E2621，基于Gibson组装原理，可以高效、准确地组装 DNA 片段。不管片段的长短和末端匹配性如何，该方法都可以无缝组装多个 DNA 片段。还可以组装单链寡核苷酸或含 15-30 bp 重叠区的不同片段长度的 DNA 片段。主要用于合成生物学和多片段的一步克隆、定点突变、sgRNA-Cas9 表达载体构建 、线性酵母表达框组装。
在同一反应缓冲液中有几种不同的酶活性：
1) 核酸外切酶活性会产生单链 3´ 突出末端，促使互补的末端重复序列（重叠区）退火
2) 聚合酶活性会填补退火片段的缺口
3) DNA 连接酶活性能在组装后的 DNA 切刻处进行连接
最终形成双链闭合的 DNA 分子，可作为 PCR、RCA 的模板或其它分子生物学应用，包括直接转化大肠杆菌。
四、In-Fusion
In-Fusion：一种操作极简的普适性无缝克隆技术
核心原理
In-Fusion 克隆的核心是 In-Fusion 酶，其兼具 DNA 聚合酶与连接酶活性，可识别目的片段与载体两端 15-25bp 的同源序列，通过同源重组介导直接连接，无需外切酶预处理，甚至可兼容 10bp 短同源臂。In-Fusion 酶对片段末端类型无要求（粘性 / 平端均可），甚至可连接带缺口的 DNA 片段。
技术流程：① 引物设计（含特异性序列 + 同源臂）；② 插入片段的 PCR 扩增与纯化；③ 载体的线性化与纯化；④ In-Fusion 高效重组反应；⑤ 转化、筛选与验证。
In-Fusion克隆标准工作流程示意图（图片来源：Takara官网）
适用场景
a. 常规无缝载体构建，如目的基因定点插入、标签蛋白融合（His、GFP 标签）。
b. PCR 产物直接克隆，尤其适合低浓度 PCR 产物（≥1ng/μL 即可），无需胶回收步骤。
c. 定点突变载体构建，通过引物引入突变位点，同时设计同源臂，一步完成突变与克隆。
五、TOPO 克隆
TOPO 克隆：一种不使用限制性酶或连接酶的 DNA 克隆方法。
核心原理
TOPO 克隆利用 Vaccinia 病毒来源的拓扑异构酶 Ⅰ 的 “切割 - 连接” 偶联活性：载体上的 TOPO 位点（含 CCCTT 序列）被拓扑异构酶 Ⅰ 切开，形成带缺口的活性中间体，酶的酪氨酸残基与载体 5’磷酸基团形成共价键；当含 5’磷酸基团的 PCR 产物（Taq 酶扩增产物）进入体系后，拓扑异构酶 Ⅰ 将 PCR 产物与载体连接，同时自身脱落，整个过程仅需 2-5 分钟，且无需 PCR 后处理，核心依赖腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的互补配对氢键。
适用场景
a. 常见亚克隆
b. Expression in E. coli
c. 长PCR片段
d. 哺乳动物细胞中的表达
e. 体外转录
f. 应用 Gateway 入门载体
g. 测序
无缝克隆虽解决了传统克隆的 “酶切位点限制” 痛点，但实操中仍需注意：同源臂设计需避免重复序列与宿主基因组同源区域，否则易导致非特异性重组；多片段组装时需严格控制各片段摩尔比，确保组装准确性；高 GC/AT 片段可通过添加 DMSO、调整退火温度等方式优化效率。
无缝克隆的 “无限制” 组装能力已重塑复杂载体构建的逻辑，但当实验需要实现基因在不同载体间的精准穿梭，或在动物体内进行组织特异性基因调控时，位点特异性重组克隆的定向性优势将更为突出。下一篇，我们将聚焦 Gateway、Cre-LoxP 等系统，解析位点特异性重组克隆如何通过重组酶与特异性位点的精准识别，实现基因的定向操作与体内调控，敬请期待！
参考文献
[1]Ligation-independent cloning for plant research Jos R Wendrich 1, Che-Yang Liao, Willy A M van den Berg, Bert De Rybel, Dolf Weijers Affiliations Expand PMID: 25757785
[2]Mechanism and specificity of DNA strand exchange catalyzed by vaccinia DNA topoisomerase type I Mary R Stahley 1, James T Stivers，Affiliations Expand. PMID: 20187656
[3] SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning.Li MZ, Elledge SJ,Methods Mol Biol. 2012;852:51-9. doi: 10.1007/978-1-61779-564-0_5. PMID: 22328425
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