技术干货 | 融合蛋白标签完全指南：从原理到应用，一篇读懂

一、什么是融合标签？

融合标签是一段已知的蛋白或肽序列，通过重组DNA技术，将其与目标蛋白的DNA一同构建到表达载体中。在表达时，标签便会附加在目标蛋白的N端或C端，从而赋予蛋白新的特性，如可被特定抗体识别、便于纯化或发出荧光。

• 纯化：提供特异结合位点，实现快速高效的亲和纯化。

• 增强表达/溶解性：帮助难表达的蛋白正确折叠，避免形成无活性的包涵体。

• 检测与示踪：作为已知“记号”，便于用抗体进行检测，或用荧光进行活细胞观察。

ab237337 staining 6X His tag® in 293T cells transfected with 6X His tag® with GFP tag.Nuclear DNA was labeled with DAPI (shown in blue) and GFP is shown in green.

（图片来源：ab237337 重组Alexa Fluor® 647荧光Anti-6X His tag®抗体[EPR20547] 免疫荧光验证图）

• 无需特异性抗体即可分离和检测目标蛋白。

• 可在纯化后通过酶切去除标签。

• 可组合多个标签，实现多功能化。

• 避免免疫沉淀中的抗体交叉反应。

• 荧光标签可用于活细胞成像。

• 某些标签可能影响目标蛋白构象或功能。

• 可能需要多次尝试以确定最佳标签位置。

二、 标签三大类别：各有所长

融合标签主要分为三类，适用于不同场景：

表位标签：短肽序列（如c-myc、HA、FLAG、V5），主要用于基于抗体的检测（Western Blot、IP、IF等）。

亲和标签：通常较长（如GST、His、生物素），主要用于蛋白纯化，也可增加蛋白溶解度。

• His标签（多聚组氨酸标签）：最常用的是6×His。分子量小，对蛋白构象与功能影响较小。

• GST标签：约26 kDa，不仅能用于纯化（通过谷胱甘肽树脂），还能显著提高蛋白的溶解度。

• 生物素标签：分子量极小（244 Da），与链霉亲和素的结合力极强，可用于超高灵敏度的检测与纯化。

荧光标签（如GFP、mCherry）：用于活/死细胞成像，研究蛋白定位与动态。

Immunocytochemical/ Immunoflurescence analysis of cytospined HEK-293 cells (Human epithelial cell line from embryonic kidney) transfected with GFP labeling GFP with ab13970 at 1/200 dilution incubated for 16 hours at 4°C with 1% BSA in PBS. Secondary used was a donkey anti-chicken polyclonal DyLight® 594 at 1/500；Nuclei are counterstained in blue (DAPI).

（图片来源：ab13970 Anti-GFP抗体免疫荧光客户验证图）

三、 C端还是N端？这是个问题

标签融合的位置（C端或N端）至关重要，取决于目标蛋白自身的结构：

• 若标签融合末端被折叠在蛋白内部，可能无法被检测。

• 若该末端发生翻译后剪切，标签可能被去除。

建议：条件允许时，可同时构建C端和N端融合的载体进行测试。研究发现，C端融合的蛋白其细胞定位和功能有时更接近天然状态。

pCMV3Tag8li-hTXLNA-HA：pCMV-3Tag-8 modified MCS载体上构建的融合表达质粒，用于表达C端带有HA标签的DDX50蛋白

(Addgene Plasmid #165472 链接：Addgene: pCMV3Tag8li-hTXLNA-HA）

PCDNA3-N3FLAG-MYB-FL：pCDNA3载体上构建的融合表达质粒，用于表达N端带有3×FLAG标签的MYB蛋白

(Addgene Plasmid#105609 链接：https://www.addgene.org/105609/)

四、 明星标签详解

• His标签（多聚组氨酸标签）：最常用的是6×His。分子量小，对蛋白功能影响小，通过固定化金属离子亲和层析（IMAC，常用镍柱）纯化。需注意在哺乳动物系统中可能存在高背景。

• GST标签：约26 kDa，可提高蛋白溶解度，通过谷胱甘肽树脂纯化。洗脱条件温和，但标签较大可能影响功能，且洗脱液可能污染热休克蛋白。

• 生物素标签：分子量仅244 Da，与链霉亲和素/亲和素结合力极强，可用于多种检测与纯化。在哺乳动物系统中需注意内源性生物素化蛋白的共洗脱。

• c-myc标签：10个氨基酸，应用广泛，但用于亲和纯化时需低pH洗脱，可能影响蛋白活性。

• HA标签：9个氨基酸，源于流感病毒血凝素，对蛋白功能影响小，但不宜用于研究凋亡细胞（会被Caspase切割）。

• FLAG（DDDK）标签：8个氨基酸，亲水性强，对蛋白功能影响小，且内含肠激酶切割位点。

• V5标签：9-14个氨基酸，某些情况下，常与His标签联用。

选择时需综合考虑：

• 激发/发射光谱：避免多色实验中的光谱重叠。

• 亮度：消光系数与量子产率的乘积。

• 成熟时间：sfGFP仅需10分钟，而mOrange可能需要4小时。

• 光稳定性（漂白）：长时间成像需选择如EGFP（T½为174秒）等更稳定的标签。

• 寡聚化状态：优先选择单体标签（如mCherry），避免二聚化干扰蛋白功能或实验（如FRET）。

• 环境敏感性：注意pH、温度、氧气对荧光强度的影响。

• 密码子优化：确保在宿主细胞中获得高效表达。

五、 融合标签的典型应用

六、 如何开始？分子量比较与选择建议

没有“wei一最佳”标签，选择需结合具体目标蛋白和应用需求。以下是一些常用场景的标签选择参考：

• 蛋白纯化：His标签、生物素

• 蛋白检测/免疫沉淀：c-myc、FLAGF

• 蛋白定位/成像：GFP、mCherry、HA

• 增加溶解度：GST、MBP

• 功能分析：FLAG等小表位标签