生物制品的全流程生产过程时刻会引入与成品无关的杂质，这些杂质如同药物中的“隐形刺客”，威胁着产品质量。在蛋白纯化工艺中，杂质的有效清除是确保生物药安全与有效的生命线。
杂质主要分工艺相关杂质（外来） 与 产品相关杂质（内源）。深刻理解杂质本质，是设计纯化工艺、获得高纯度蛋白产品的基石。
01工艺相关杂质“清剿名单”
图·不锈钢生物反应器系统
定义：指在生产过程中引入的、与目标蛋白本身无关的杂质。可能来源于表达系统、细胞培养、发酵、纯化工艺等整个生产链。
01宿主细胞蛋白（HCP）
表达目标蛋白的宿主细胞（如大肠杆菌CHO细胞、酵母等）自身产生的蛋白。
分子大小：近 75% 处于 25-75kDa
等电点：近 70% 小于 6.0
最难去除的工艺杂质之一。某些HCP具有酶活性，可能降解目标蛋白；异源HCP还可能引起人体的免疫反应。
02宿主细胞核酸（HCD等）
宿主细胞产生的DNA和RNA片段；
分子大小：10-1000kDa，<500nm；
等电点：pKR＜2
03细菌内毒素
来源：革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）细胞壁的成分脂多糖。即使宿主不是细菌，在实验操作中也极易由器皿或试剂污染引入；
分子大小：单体10-20kDa；聚体1000kDa，0.1um；
等电点：pI3.1，某些过百万分子量的高聚体内毒素的电荷不外露。
04脱落蛋白A
Protein A亲和层析捕获步骤，层析填料配基脱落的蛋白；
分子量：Native PrA, 42kDa；rPrA， 34.3kDa；SuRe，27kDa。
05培养基成分
细胞培养或发酵过程中添加的物质；
如：胰岛素、消泡剂、重金属、聚体、生长因子、脂质、抗生素（如青霉素）、诱导剂（如IPTG）、血清等。
06病毒和微生物
动物细胞表达，可能存在潜在的内源或外源病毒污染。整个生产过程也需防止微生物污染；
一般通过模型病毒进行验证。
去除策略：主要靠下游纯化工艺的优化。结合不同分离原理的纯化步骤（如离子交换、疏水、分子筛等）来去除各类杂质。
02产品相关杂质“整顿清单”
图·典型离子交换层析杂质分离图谱
定义：指目标蛋白本身由于翻译后修饰、化学降解或错误折叠而产生的分子变体。它们与目标蛋白的氨基酸序列相同或极其相似，但在结构、电荷或功能上存在差异
01聚集体
蛋白质分子通过非共价或共价作用形成二聚体、寡聚体甚至可见的沉淀。可能显著增加产品的免疫原性风险；
分子大小：大于单体；
等电点：同单体，但较单体带有更多电荷；
疏水性：强于单体。
02降解片段
在生产和储存过程中，蛋白质会发生水解、β-消除等化学降解；
分子大小：小于目标分子。
03电荷异构体
脱酰胺、C末端Lys的截除、N端谷氨酰胺的环化、唾液酸含量不同等，都会导致电荷异构体的产生。
分子大小：和单体相当；
等电点：与单体接近。
04疏水变体
分子大小：与单体相当；
等电点：与单体接近。
去除策略：由于产品杂质与目标产品的物理化学性质非常接近，去除更具挑战性。常用方法：
①IEC离子交换色谱：分离电荷变体。
②HIC疏水相互作用色谱：可用于分离某些氧化变体或疏水性不同的变体。
③SEC分子排阻色谱：分离聚集体和单体经典方法。
④应对策略前移：更重要的是从上游控制，如优化细胞培养条件（温度、pH、溶氧）、构建更稳定的细胞株、或对蛋白序列进行理性改造，优先从源头上减少产品杂质的生成。
03纯化策略总结
原则：
多步联用：单一方法难以彻底去除所有杂质，通常采用“捕获→中度纯化→精制”三步策略。
优先使用高选择性方法：如亲和层析（第一步）、混合模式色谱（应对复杂杂质）。
结合物理化学性质：利用电荷（IEX）、疏水性（HIC）、大小（凝胶过滤）、特异性（亲和）等多维度分离。
工艺可放大性与成本平衡：实验室可用梯度洗脱，工业生产更倾向分步洗脱以控制成本。
— Protein Purification —
示例流程（单抗生产）：
Protein A 亲和层析 → 去除HCPs、部分病毒、聚集体（初步捕获）
阴离子交换色谱（AEX） → 去除残留HCPs、DNA、病毒等
根据HCP、HCD、和Protein A的等电点特点，可以推测pH越高，三者与阴离子交换层析填料结合能力越强，去除能力越好。
根据聚集体比单体带有更多电荷的特点，可以通过阴离子交换层析结合模式，进行线性梯度洗脱，达到去除聚集体的效果。
根据病毒等电点的特点可以推测，pH越高，病毒去除的能力越好
阳离子交换层析（CEX） → 去除聚集体、片段、电荷异构体等
注意事项：
避免反复冻融与剧烈震荡，防止蛋白变性产生新杂质。
缓冲液设计模拟胞内环境，维持pH稳定（远离pI），添加DTT/EDTA保护活性。
优先选择兼容性好的工艺顺序，使前一步洗脱液适合下一步上样条件（如HIC后接GF，阳离子洗脱样品接除病毒过滤）。
尽可能全程低温操作，抑制蛋白酶活性，防止降解。
综上，工艺相关杂质侧重于“来源控制+多步清除+安全性评估”，产品相关杂质则依赖“结构差异分离+条件优化”，二者需结合具体蛋白特性与生产工艺综合设计纯化路线。
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