解锁微量DNA分析的秘密武器：WGA技术详解（下）

(1-4)在第一阶段，DOP-PCR引物在非特异性条件下与模板DNA结合并进行扩增。

(5,6)在第二阶段，引物在高严格条件下针对第一阶段合成的扩增产物进行扩增，从而生成复制品的复制品。

先将基因组 DNA 进行片段化处理，可采用物理剪切或限制性内切酶处理。物理剪切后需平末端化处理，限制性内切酶处理则多数情况下无需后续处理。接着设计与酶切片段匹配的接头，在DNA连接酶作用下与模板片段两端相连，接头含外源通用引物序列。连接成功的模板片段经引物延伸形成通用引物结合位点，进而能用外源通用引物进行 PCR 反应，实现模板片段扩增，然后二代测序分析。

IRS-PCR（Infrequent-Restriction-Site PCR，低频限制性位点PCR）是一种基于限制性内切酶和 PCR 技术的分子分型方法，主要用于分析基因组的多态性，尤其适用于细菌、真菌等微生物的菌株分型或基因组结构差异研究。该技术的特点是选择性扩增低频限制性内切酶识别位点与高频限制性内切酶识别位点之间的DNA序列。

通常以HhaI作为高频限制性内切酶,XbaI作为低频限制性内切酶。双酶切染色体后产生的两端侧翼同时含有这两种酶识别位点的双链DNA片段就是研究对象,如片段两端为同种酶切位点则被淘汰。以所选择酶为基础构建两个接合子(adaptorAX,AH,各含大小两个片段,其末端能与酶切片段互补),通过连接酶体系连接于所选片段的粘性末端,再根据接合子构建相应引物(PX,AH1可充 当另一引物),进而完成片段扩增过程。

PEP-PCR 以随机组成的15个碱基寡核苷酸为引物，理论上这种引物存在415种排列顺序。在PCR反应时，其每个循环的退火温度是由 37°C连续升温至 55°C，这种设置能确保不同组成的引物可以与尽可能多的基因组序列退火，使得引物在低温 37°C下可随机地与基因组DNA的大量位点进行退火，并于55°C时实现延伸，从而达成对整个基因组 DNA 的随机扩增。

T-PCR（Tagged Random Primer PCR），标签随机引物 PCR 是一种结合了随机引物扩增与标签序列标记的 PCR 衍生技术，用于随机扩增整个DNA分子和基因组，扩增范围从400碱基对(bp)到40兆碱基(Mb)。这一简单、两步式的PCR策略采用标记的随机引物，其中包含一组所有可能的3"序列，用于结合目标DNA，以及一个恒定的5"区域，用于检测被引入的引物。通过这种方法，仅需1pg DNA就能被有效扩增，且扩增产物在溴化乙锭染色的凝胶上可以清晰可见。

两步扩增机制：

• 第一步为低严谨性扩增：随机序列部分可与基因组 DNA 或病原体核酸的多个位点随机结合，在较低退火温度下启动扩增，实现对未知序列的非特异性覆盖。

• 第二步为特异性扩增：利用 5' 端的固定标签序列设计引物，对第一步扩增产物进行特异性指数扩增，同时通过标签序列实现对产物的标记或后续测序、定量等分析。

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• 扩增环节：热稳定性 DNA 聚合酶（如高保真 Taq 酶）确保扩增效率与准确性，适配不同 WGA 技术的反应需求；

• 连接环节：高活性 T4 DNA 连接酶，16℃过夜反应也能保持稳定，减少 LM-PCR、LA-PCR 中的接头连接失败问题；

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