反相色谱中流动相的选择

反相高效液相色谱（RP-HPLC）是目前应用最广泛的一种分析方法，具有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，应用范围广等特点，约占目前 HPLC 分析应用的 80%。RP-HPLC 固定相主要包含非极性烷基烃，例如与二氧化硅或其他惰性载体结合的 C8 或 C18 链。C18 和 C8 是指色谱柱键合相的烷基链长度。链长影响吸附剂相的疏水性，从而增加配体的保留。C18 比其他反相更具疏水性（非极性更强）的原因是碳链的长度更长。而在反向高效液相色谱（RP-HPLC）分析的过程中，选择合适的流动相往往可以控制样品的保留时间和分离度（图 1）。

流动相的性质包括有机溶剂的种类、混合比例、添加剂和 pH 值等，这些因素对分析实验结果产生着不可忽视的作用，因此选择合适的流动相对于液相色谱的分析至关重要。在反相高效液相色谱中，一般来讲，流动相 B 是有机溶剂，常用于泵的流动相混合和梯度洗脱；流动相 A 主要是水，通常也会含有少量控制 PH 和离子强度的改性剂或缓冲盐等。

图 1 RP-HPLC 中流动相与固定相之间的相互作用

表 1 有机相的洗脱强度

 

例如，在实际应用中，我们会发现洗脱效果 44% 甲醇/水 = 35% C2 H3N/水 = 28%= C4 H₈O/水。虽然 C4 H₈O 的洗脱效果比较好，但是由于 C4 H₈O 的毒性和安全性问题，导致其在实验过程中应用的比较少。而日常实验中应用最多的有机溶剂是 C2 H3N 与甲醇，两者比较而言，C2 H3N 洗脱强度高、粘度低、紫外干扰弱，但是价格较贵；甲醇洗脱强度不如 C2 H3N、粘度高、在 210nm 以下有着显著的紫外吸光度，但是甲醇价格较便宜。

 

一般在初始分离条件中，有机溶剂的比例定为 80%，然后逐步减少有机相比例，直到保留因子（k）落在所期望值的范围内，即 1 ≤ k ≤ 10，再考虑分离度、拖尾因子和出峰时间等因素，优化出合适的流动相比例。当单独使用 C2 H3N 和甲醇或单一有机溶剂不能达到洗脱效果时，就应该要考虑有机溶剂的混合使用。若等度洗脱不能有效分离样品时，就要考虑梯度洗脱的方法。但是使用梯度洗脱时，流动相有机溶剂最高比例不得大于 90%。

2.1、水相的选择

图 2 在 C18 色谱柱上进行梯度洗脱。以超纯水为流动相 A，C2H3N 为流动相B。结果显示，水的纯度越高，紫外吸收干扰越小

2.3、离子对试剂的选择

图 3 IPC 离子对试剂工作原理。通过与流动相中的离子对试剂相互作用来改变分析物的极性。