HPLC 方法开发中常见的问题与解决方案

 

HPLC分析流程

一、梯度洗脱条件的设置

典型的梯度洗脱是用两种溶剂做流动相，弱溶剂 A 和强溶剂 B，在反相色谱分离中溶剂 A 大都是水，溶剂 B 是甲醇或者乙 jing 等强溶剂。所有的梯度洗脱中溶剂强度不断增加，即 B 的浓度不断增加。例如, 流动相中溶剂 B 的含量在一定时间内梯度从 20% 提高到 80%。梯度控制器决定流动相的组成，可通过输入不同的条件实现：

①流动相 (梯度洗脱开始时): cB(%);

②流动相 (梯度洗脱结束时): cB(%);

③从分离开始到结束的梯度时间;

④梯度形状;

等度洗脱、线性洗脱、梯度洗脱分离效果

二、负峰的消除

从方法原理上讲, 当样品池的吸收值低于参比池时可产生负峰现象, 因此要求用流动相

溶解样品或稀释样品。当分析物为两性化合物时，由于样品本身极性较大，且化合物结构中含有氨基，极有可能与检测池壁产生相互作用, 产生负峰现象，这种情况下需要在流动相中加入 NH4+来减少负峰现象。

三、进样量对分离效果的影响

一般在保证灵敏度的前提下应尽量减少进样量，以避免可能发生的溶剂效应。特别是于样品性质的特殊性不同，导致溶解样品的溶剂与流动相组成不同时更应注意该问题，需要保证每次的进样量在 1μL-5μL。例如，在做靛蓝、靛玉红分析时, 对照品及样品溶液为氯 fang 溶液, 流动相为甲醇/水 (70:30), 当进样量为 20μL 时, 色谱系统会出现异常峰, 再次将进样量改为 10μL 时则出峰正常。

四、含有氨基结构化合物的峰拖尾问题

氨基化合物拖尾峰

五、流动相中甲醇与乙 jing 的选择

常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙 jing。乙 jing 虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙 jing，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度。

Thermo ScientificTM ChrompleteTM 色谱通溶剂，一瓶通用。适用于多种应用：

• HPLC: UV、UV-Vis、PDA、ECD、FL 或 RI 检测器  

• GC: FID、ECD 或 TCD 检测器  

• 紫外分光光度法

• 萃取、纯化和超临界流体色谱

• 优势--兼容多种应用场景，减少实验室所需的试剂瓶数量，大大简化库存管理并减少试剂浪费。

六、流动相的PH问题

利用反相色谱法分离弱酸（3 ≤ pKa ≤ 7）或弱碱（7 ≤ pKa ≤ 8）样品时，可以通过调节流动相的 pH 值，以抑制样品组分的解离，从而增加组分在固定相上的保留，并改善目标化合物的峰形。对于弱酸性化合物来讲，流动相的 pH 值越小，组分的 k 值越大；当 pH 值远远小于弱酸的 pKa 值时，弱酸主要以分子形式存在。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液和 1% 醋 suan 溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液和 30 mmol/L 三乙 an 溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅羟基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。