你真的了解你的色谱柱吗？

（一）色谱柱介绍

在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想的分离，是色谱工作者的重要工作。色谱是一种分离分析的手段，而色谱柱在分离过程中起着举足轻重的作用，是色谱系统的核心。

（二）色谱柱的填料

硅胶是目前HPLC中最常用的基质。除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的gui烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱。C18柱稳定性较高，这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故，但是由于C18基团空间体积较大，有效孔径小，所以C18色谱柱更适合分离小分子化合物。

色谱柱硅胶基质上的C18烷基链

（三）色谱柱的分类

色谱柱可分正相模式色谱柱、反相模式色谱柱和亲水模式柱（HILIC）

01 反相模式色谱柱 

一般用非极性固定相，以硅胶为基质键合不同的基团（如C18、C8）；适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱（RPC）在现代液相色谱中应用最多，据统计它占整个HPLC应用的80%左右。由于超临界色谱（SFC）的崛起，一些过去用正相色谱的实验逐渐被超临界色谱所代替，所以未来反相色谱柱的应用将会更加广泛。随着色谱柱填料的快速发展，某些无机样品或易解离样品的分析也可用反相色谱法。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲盐控制流动相的PH值。硅胶基质键合相（C8和C18）色谱柱使用的PH值通常为2-8，太高的PH值会使硅胶溶解，太低的PH值会使键合的烷基脱落。近年来技术的更新，利用包被、空间位阻、杂化颗粒等新技术，已经可以使硅胶基质的色谱柱使用范围扩大到PH为1-12，流动相为较强酸性或碱性时，可选择宽PH值的色谱柱。

02 正相模式色谱柱 

采用极性固定相（如乙二醇、氨基与腈基等键合相）；常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）

03 亲水(HLIC)模式色谱柱 

HILIC不同于反相色谱技术，流动相为反相色谱的流动相，它提供了相对于反相的互补选择性，通常可保留传统反相色谱方法无法保留的高极性化合物。

（四）选择合适的色谱柱

色谱柱的选择可根据待分析样品的极性、分子量大小、是否可溶于水等因素来考虑。如样品分子量大于2000的，可溶于水的，可选择凝胶色谱柱、大孔径反相色谱柱、大孔径离子交换色谱柱。分子量小于2000的，溶于有机相的，可选择正相模式色谱柱。溶于水，可电离的样品可选择反相模式（用离子对试剂的键合固定相、用离子化控制键合固定相）色谱柱或离子交换或未经涂渍亲水模式的色谱柱等。

（五）色谱柱使用的注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要，如果处理不当就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以延长色谱柱的寿命。

• 避免压力、温度的急剧变化和强烈的震动。
• 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱，不应直接从有机溶剂直接改变为水相，反之亦然。
• 色谱柱不宜反冲，反冲会迅速降低色谱柱的柱效。
• 避免生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理，还可以在进样器和色谱柱之间连接保护柱。而且保护柱也应该经常更换。

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有无SecurityGuard保护柱的色谱柱进样口扫描电镜比较

• 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在清洗色谱柱时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75mL。
• 保存色谱柱时应用乙jing或色谱柱说明书上指定的溶剂充满色谱柱，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥，禁止将缓冲盐溶液留在柱内静置过夜。使用含有缓冲盐的流动相时，可先用高比例的水替换掉色谱柱中的有机相，然后再用含有缓冲盐的流动相，实验结束后，用高比例的水替换掉缓冲盐，冲洗20倍的柱体积，再逐渐升高有机相的比例，直至100%乙jing或高比例乙jing，冲洗20倍柱体积，保存色谱柱。装在高效液相色谱仪上的柱子如不经常使用，应每隔4-5天开机冲洗15分钟。

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